陈秋强++胡朝晖++徐建中++倪方方++徐红梅++宋腾蛟++袁小凤
【摘 要】杭白术Atractylodes macrocephalae有严重的连作障碍，前期研究发现白术根际土壤有机溶剂浸提物对幼苗生长有显著抑制作用，但具体是哪些化合物还不清楚。利用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）检测连作后白术根际分泌物组分及含量的变化，以阐明白术的连作障碍机制。共鉴定出16种化学成分，主要为酚类（3种）、芳香烃（3），烷烃（3），烃类衍生物（2）、醇类（2）、酯类（1）、胺类（1），除S-氰戊菊酯、氟啶胺和谷甾醇外，其余13种均为化感物质。 在正常种植、连作2年、3年的白术根际土中均检测到3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛、惹烯、2，4-二叔丁基苯酚、2，6-二叔丁基对甲酚、2，4-二（1-苯乙基）-苯酚等5种化合物，只是这些物质的含量随连作年限增加而减少。连作白术根际中根泌物的种类明显增加，连作3年的白术死苗中检测到15种，连作2年的死苗中有9种，其种类远超过活苗，可见白术的死苗与这些化合物有着必然的联系。综合比较后发现，2，6-二叔丁基对甲酚、四甲基联苯、对二甲苯以及对氯苯基-6，8-二氯-7-苯并吡啶是导致白术自毒作用的主要根泌物。连作后很多白术会向土壤分泌一些化感物质，例如2，6-二叔丁基对甲酚、四甲基联苯、对二甲苯以及对氯苯基-6，8-二氯-7-苯并吡啶，正是这些物质的自毒作用，导致白术发生连作障碍，其具体机制有待进一步研究证实。
【关键词】杭白术 连作障碍 根系分泌物 气质联用仪 化感作用
白术Atractylodes macrocephalae属菊科多年生草本，以干燥根茎入药，是著名的道地药材“浙八味”之一。它作为一种传统的中药材，具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎之功效，常用于脾虚食少、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安等症[1-2]。杭白术有非常严重的连作障碍，这不仅给药农带来了巨大的经济损失，而且制约了我省道地药材的产业化生产。研究表明，作物之所以有连作障碍的主要是因为土壤理化性质变劣、化感自毒作用以及土壤微生物区系的改变[3]。其中，化感自毒作用主要是指连作后植物会产生一些化感物质，这些物质通过影响细胞膜通透性、酶活性、蛋白质的合成等多种途径来影响植物生长[4]。我们的前期研究表明，白术根际土壤有机溶剂浸提物对幼苗生长有显著抑制作用[5]，但具体是哪些化合物还不清楚。因此，本实验拟对检测连作后白术根际土壤中的化合物，分析连作后白术根际土壤中有机化合物成分及含量的变化，为探讨杭白术的连作障碍机制提供证据。
1 材料与方法
1.1 实验设计和样品采集
野外栽培实验设在规范栽培基地磐安，实验田分3组：连作3年的杭白术、连作2年的杭白术，第1年种植的杭白术。试验地设在同一块地，土壤类型完全相同，每组1m×5m，相邻而种，整个实验过程设专人管理。
连作白术的死苗率很高，而未连作的白术没有死苗，为分析死苗和活苗的根际土差异，我们分别采集活苗和死苗的根际土。在7月份一个晴天的下午采样，利用土培收集法收集根分泌[6]，具体如下：按照五点采样法分别采集连作3年、连作2年以及种植1年的白术根际土，同时采集连作3年、连作2年的死亡白术的根际土。采集根际土的方法如下：先拨开表层土，将整株根系从土壤中挖出，抖掉与根系松散结合的土块，然后将与根系紧密结合在4mm 范围内的土壤用毛刷刷下，过2mm尼龙筛后即为根际土，然后装袋带回。此外，收集附近未种植物的空地土壤，过筛、装袋，速带回实验室，自然风干，备用。每组样品3个重复。
1.2 土壤理化性质分析
利用电极法测土壤pH[7]。称取10g过20目筛的风干土样于50 mL 烧杯中，加入25 mL 无CO2 蒸馏水，用玻璃棒混和均匀，静置30 min，同时注意避免空气中NH4或挥发性酸等气体的影响。将玻璃电极与甘汞电极插入土壤悬液中，读取pH值。每份样品测定结束后即用蒸馏水冲洗电极，并用干滤纸将水吸干，每份样品测三次。
采用低温外热重铬酸钾氧化-比色法[8]，称1g过100目筛的风干土样，放入50mL普通试管中，加5mL重铬酸钾溶液和5mLH2SO4，摇匀（同时做无土样空白），放入100℃恒温箱中，90min后放冷水浴中冷却，用注射器加水至50mL，摇匀停放3h或过夜，取上清液比色，用1cm光径比色杯在590nm波长测定吸收值。用空白样液调比色计零点。
采用靛酚比色法（苯酚-次氯酸钠比色法）测土壤脲酶活性[9]。称取5.0000g过100目筛的风干土样于50mL三角瓶中，用1mL甲苯处理（以能全部使土樣湿润为度），15min后加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸盐缓冲液（pH6.7）。仔细混合后，将反应物放入37℃恒温培养箱中培养24h，对每个样品设用10mL水代替基质作有土无基质对照，整个实验设无土无基质对照。过滤后取3mL滤液于50mL容量瓶中，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20min，用水稀释至刻度。将着色液在分光光度计上于578nm处进行比色测定。每个样品3个重复。
采用磷酸苯二钠比色法[9]测土壤磷酸酶活性。称取5.0000g过100目筛的风干土样于50mL三角瓶中，加入0.25mL甲苯，再加入20mL 0.5%磷酸苯二钠溶液，充分振荡后于37℃温育2h，对每个样品设用20mL水代替基质作有土无基质对照，整个实验设无土无基质对照。取培养后的滤液5mL置于50mL容量瓶，加入蒸馏水20mL，再加入0.25mL氯化铵-氢氧化铵缓冲液（pH9.8），0.5mL 2% 4-氨基氨替比林液，0.5mL 8%铁氰化钾液，每次加入试剂都要充分摇匀，最后定容至刻度，15min内在分光光度计上于510nm处进行比色测定。每个样品3个重复。
1.3 土壤中有机化合物的提取
每组称取根际土10 g，加入100 mL蒸馏水溶解，然后振荡离心，上清液即为根分泌物，浓缩后至于具塞锥形瓶中，加入正己烷50 mL淹没样品，20 ℃超生浸提30 min（SK2510HP超声波清洗仪，上海右一仪器有限公司），离心、过滤得上清液，20 ℃旋转浓缩至1 mL（R-201浓缩仪，上海申顺生物科技有限公司），过0.45μm微孔有机滤膜后，作GC-MS检测。
1.4 GC-MS分析
检测仪器为安捷伦气相色谱-质谱联用仪（气相色谱仪Agilent Technologies 7890；质谱检测器Agilent Technologies 5975）。采用电子轰击源，轰击电压70eV，扫描范围M/Z30-500，扫描速度0.4s扫描全程。毛细管柱：SE-54（30 m×0. 25 mm ×0. 25 μm），离子源温度：230 ℃；进样口温度：250 ℃；接口温度：280 ℃；箱温度程：70 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃；载气为He，流量1mL/min，不分流进样，进样量为1 μL。通过质谱分析和计算机标准普库检索，并采用峰面积归一化法确定各化合物的相对百分含量。
2 结果分析
2.1 连作后土壤理化性质的变化
白术活株根际土的pH值和磷酸酶活性低于死株的根际土，但活株根际土的有机质含量高于死株根际土如图1。土壤理化性质的差异说明了白术在不同时期会分泌不同的根泌物，这些根泌物会影响土壤的理化性质。同时，土壤也会反过来影响白术的生长。随着连作年限的上升，白术根际土的pH明显升高，而磷酸酶活性则表现出先上升，在第三年下降的趋势。有机质的含量变化不大，范围为2.5-2.66%。与非根际土相比，根际土的pH和磷酸酶活性均上升。
利用GC-MS对不同生长年限、不同生长状态的杭白术根际土壤浸提液进行质谱扫描，质谱如图2所示。各色谱峰通过计算机自动在Willey等质谱数据库中查找，匹配度在80%以上的有机化合物共16种如表1，主要为酚类（3种）、芳香烃（3），烷烃（3），烃类衍生物（2）、醇类（2）、酯类（1）、胺类（1），除S-氰戊菊酯、氟啶胺和谷甾醇外，其余13种均为化感物质。经文献调查，S-氰戊菊酯为农药残留物[10]，氟啶胺是一种保护性杀菌剂，对诱发杭白术白绢病的致病菌有抑制作用[11]。谷甾醇具有抑菌活性[12]，除此之外，其余13种均为化感物质。
2.2 连作对白术根际分泌物的影响
在种植1年的白术根际土中检测到了5种化合物，包括酚类3种、烯烃类1种、醛类1种，而连作白术根际土中也检测到这5种物质，这些分泌物的含量随着种植年限的增加均表现出下降的趨势，说明连作后白术根分泌3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛、惹烯、2，4-二叔丁基苯酚、2，6-二叔丁基对甲酚、2，4-二（1-苯乙基）-苯酚等物质的量会减少。此外，在连作白术根际土中，除了这5种物质以外，还检测到粪甾烷-3-醇及8-异丙基-1，3-二甲基菲、S-氰戊菊酯，这3种物质的含量均表现出连作3年比连作2年更高，说明连作会促进这些物质分泌。
2.3 白术死亡后根际分泌物的变化
连作后，白术会产生连作障碍。比较死苗和活苗白术的根际分泌物组分发现，死亡白术根际土中化合物种类明显增加，连作3年的白术死苗中检测到15物质，而活苗中仅有8种；连作2年的死苗中检测到9种物质，活苗仅6种，可见白术的死苗与这些化合物有着必然的联系，连作促进了白术化感物质的分泌。连作2年的白术死苗根际比活株中多了3种化合物，分别为8-异丙基-1，3-二甲基菲、氟啶胺、粪甾烷-3-醇；而连作3年的白术死苗根际则比活株多了7种化合物，分别为2，2'，5，5'-四甲基联苯、对二甲苯、2，6，10，14，18-正二十二烷、二十九烷、对氯苯基-6，8-二氯-7-苯并吡啶、氟啶胺、谷甾醇，这些多出的化合物必定与连作障碍相关。此外，2，6-二叔丁基对甲酚的百分比在连作3年的死苗根际最高，其含量是连作3年活苗的26倍，连作2年活苗的8倍，是正常种植白术的6倍，值得进一步关注。2，4-二（1-苯乙基）-苯酚在死苗根际的含量均比活苗高，而2，4-二叔丁基苯酚则在死苗根际的含量比活苗低。
2.4 根际土壤与非根际土壤中化合的差异
在白术非根际土中一共检测到了8种化合物，有7种与白术根际相同，说明这些化合物可能是土壤中共有的物质。其中，1-乙苯基-1-苯基乙烷是白术非根际其特有的。与非根际土相比，种植杭白术后的土壤中新出现了7种化合物，分别是2，2'，5，5'-四甲基联苯、对二甲苯、8-异丙基-1，3-二甲基菲、对氯苯基-6，8-二氯-7-苯并吡啶、氟啶胺、S-氰戊菊酯。
3 讨论
研究表明，根泌物对土壤颗粒大小、分布情况、吸附性、稳定性及亲水性等物理性质均有显著影响[13]。根泌物还能影响根际土壤pH，究其原因，主要是因为植物根对阴阳离子吸收不均衡[14]、以HCO3-、Cl-和SO42-为主植物根泌物中有机阴离子的释放[15]、根泌物中含草酸、柠檬酸和苹果酸等有机酸[17-20]、植物根部的呼吸作用[21-22]等。我们研究发现，白术连作死苗的根际pH明显高于活苗，说明白术根泌物分泌会提高根际土壤酸度，而死亡以后这种影响也随之消失。
白术忌连作，其种过之地须隔 5-10 年才能再种，否则其病害发病率大大提高，严重时甚至绝苗绝收。安信伯等[10]研究结果表明，重茬白术易患根腐病，所引起的死苗率达50%以上，重病田则达90%。我们在连作1年、2年的土壤上继续种植白术，发现其死苗率也在一半以上。比较不同连作年限的白术活苗根分泌物发现，无论连作与否，或连作2年还是3年，其活苗中的根泌物种类基本相同，均包括3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛、惹烯、2，4-二叔丁基苯酚、2，6-二叔丁基对甲酚、2，4-二（1-苯乙基）-苯酚等物质，差异主要体现在分泌的量不同。连作后这些化感物质分泌量明显减少，而且这些物质在白术的非根际土中也有检测到，说明这些化合物含量的增加或减少应该不是导致白术死亡的主要原因，但2，6-二叔丁基对甲酚例外。它虽然在所有样品中均检测到，但在死苗中的含量远超活苗，而且随着连作年限增加含量急剧上升，说明2，6-二叔丁基对甲酚是连作白术的化感自毒物质，它的高分泌量应该是白术死苗的主要原因之一。
大量报道称，酚类物质具有一定自毒作用，可抑制种子的萌发、幼苗的生长、以及通过影响核酸和蛋白质合成而抑制植物的生长[11]。张新慧等[12]发现2，4-二叔丁基苯酚对桑科植物啤酒花Humulus lupulus具有强烈的化感自毒作用。高浓度的2， 4 - 二叔丁基苯酚作用下啤酒花根际微生物数量下降，多样性指数降低，其地上生产力也相对较低。马云华[13]研究表明，酚酸类物质能够刺激真菌的繁殖与生长，或是为真菌的生长提供了有效碳源，而连作白术大部分死亡原因是白术感染了真菌土传病害如根腐病、白绢病等[14]。此外，酚类物质还可破坏细胞的完整性使病原菌入侵[15]。白术之所以死亡，是因为连作后白术向土壤中分泌了高浓度的2，6-二叔丁基对甲酚，该化感物质的存在促进了真菌尤其是致病真菌在白术根部土壤中的生长和富集，同时由于酚类物质的存在白术根部细胞遭到破坏，致使病菌更容易入侵植物根部，最终导致白术的连作障碍。具体机制还有待于下一步研究证实。
在检测到的白术根泌物中，大部分均为化感物质，这些物质可通过浸析、挥发、植物残体分解和根系分泌等方式进入环境中[25-26]。其中，根系分泌物种类复杂，其组成和含量的变化是植物响应环境胁迫最直接、最明显的反应[27-28]。我们前期研究发现，白术栽植土壤的有机溶剂浸提液对白术幼苗生长有显著抑制作用，推测导致白术连作障的原因很可能是白術的自毒作用。GC-MS检测结果发现，发生连作障碍的白术死苗根际中的确分离到了很多化合物，其化合物的种类远超过未发生连作障碍的白术活苗。对照白术活苗和死苗根际、不同连作白术活苗根际，以及白术根际与非根际中的各类化合物的组成与含量，综合分析认为，除2，6-二叔丁基对甲酚外，四甲基联苯、对二甲苯以及对氯苯基-6，8-二氯-7-苯并吡啶等化感物质的分泌可能也是导致白术死苗的主要原因。
4 结语
由于根际土壤中化合物的种类较多，包含不同极性的化学成分，本研究采用GC-MS主要分析了杭白术根际土壤化合物中非极性成分。研究结果表明，连作后很多白术会向土壤分泌一些化感物质，其中2，6-二叔丁基对甲酚、四甲基联苯、对二甲苯以及对氯苯基-6，8-二氯-7-苯并吡啶，由于这些物质的存在，最终导致白术发生连作障碍而死苗，其具体机制有待进一步研究证实。
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