皮照兴+廉玉利+李依娜+孟德勇
【摘 要】本文介绍了细胞分裂素的种类和生物合成过程，阐述了异戊烯基转移酶是细胞分裂素生物合成过程中的重要限速酶，其编码基因ipt已被克隆并在植物基因工程得到广泛应用。重点综述了转化ipt基因可增加植物内源细胞分裂素的含量，在延缓叶片衰老、提高作物产量、诱导单性结实、抗旱、抗病虫害、抗寒等方面起到了显著作用，并分析了ipt基因在植物基因工程中应用研究方向。
【关键词】细胞分裂素 异戊烯基转移酶 基因工程
【Abstract】In this paper， the species and biosynthetic process of cytokinins are introduced. Isopentenyl-transferases catalyze the rate-limiting step of cytokinin biosynthesis， and its coding genes have been cloned and used widely in plant genetic engineering .The overview of the ipt gene transformation can be increased endogenous cytokinin content which has significant effect in retard leaf senescence， increase crop yield， induced parthenocarpy， drought resistance， disease resistance and insect resistance， cold resistance and other aspects.At the same time， the paper analyzed the application and research direction of the ipt gene in plant gene engineering.
【Key words】Cytokinin； Isopentenyl-transferase gene （ipt）； genetic engineering
细胞分裂素是植物生长发育过程中五大类植物生长调节剂之一，在促进细胞分裂和扩大、诱导器官分化、延缓叶片衰老进程以及在种子萌发和逆境应答等重要生理生化反应方面均发挥着重要的作用。异戊烯基转移酶是催化细胞分裂素生物合成的关键酶，也是最重要的限速酶。本文就细胞分裂素的合成、异戊烯基转移酶基因（简称ipt基因）以及其在植物基因工程上应用进行了综述，旨在为探索细胞分裂素生理作用机理及异戊烯基转移酶基因在植物基因工程上应用奠定理论基础，同时也为通过调整植物激素进行作物遗传育种展示了广阔的应用前景。
1 细胞分裂素的生物合成与 ipt基因
细胞分裂素在植物种子萌发、去黄化现象、叶绿体分化、顶端优势、植物抗逆反应、花和果实的发育和叶片衰老等生长发育都具有十分重要作用。Lethan在1963年报道的从未成熟玉米种子中分离出的反式玉米素是发现最早并纯化的细胞分裂素（t-Zeatin）[1]。细胞分裂素主要包括嘌呤型和苯基脲型两种类型，至今尚未在植物体内发现天然存在的苯基脲型细胞分裂素或有活性代谢物。
1.1 细胞分裂素的生物合成
细胞分裂素的生物合成包括tRNA合成途径与从头合成途径。其中tRNA合成途径是以tRNA分解释放出来的顺式玉米素为底物，在顺反异构酶的催化下合成高活性的反式玉米素[2，3]，该途径是细胞分裂素合成的次要途径。从头合成途径是细胞分裂素生物合成的主要途径，包括ATP/ADP途径、AMP途径和旁路途径如图1所示。
1.2 ipt基因
Taya等[4]和Akiyoshi等[5]分别从黏菌（Dictyostelium discoideum）和致癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中鉴定出一种酶，该酶可催化AMP和IPP合成有活性的细胞分裂素iPMP，该酶称之为IPT酶，它是细胞分裂素从头生物合成限速酶，编码该酶的基因称为ipt基因。随后在其它细菌和植物中也发现有ipt基因，2001年，Takei等[6]和 Kakimoto等[7]从拟南芥中鉴定出9个ipt同系物，命名为AtIPT1～AtIPT9。经系统发育分析表明AtIPT2和AtIPT9编码准tRNA-异戊烯基转移酶（tRNA合成途径），而其它的7个基因在大肠杆菌中的表达可导致异戊烯基腺嘌呤和玉米素的分泌，表明这7个基因在拟南芥中是编码细胞分裂素生物合成的基因且具有组织特异性。Sakamoto等在水稻中鉴定出8个ipt基因（OsIPT1～OsIPT8）编码异戊二烯基转移酶并参与到细胞分裂素生物合成的过程中[8]。
从图1可以看出，细菌中纯化到的IPT酶利用AMP为底物合成玉米素，而拟南芥中纯化得到的AtIPT酶优先利用ATP和ADP作为底物，推测该酶可能先合成iPTP和iPDP，再经羟基化合成嘌呤型的细胞分裂素[9]。近年来研究表明，在拟南芥中存在一个不依赖于iPTP/iPDP、iPMP的细胞分裂素合成途径，该途径可能是由ATP、ADP、AMP和萜类化合物前体（HMBDP）直接完成的[10]，在农杆菌、大肠杆菌和黄木樨根瘤菌也分离鉴定出了间接途径合成异戊烯基转移酶基因——miaA基因[11]。
2 IPT基因在植物基因工程上的应用
已有研究表明通过转化ipt基因可增加植物内源的细胞分裂素含量，可以延缓植物叶片的衰老，增强植物对非生物逆境的抗性，使植株保持高水平的光合作用，以提升农作物的产量、改善品质。
2.1 延缓叶片衰老
植物叶片衰老的遗传机制是通过细胞核基因表达调控和环境因子影响来启动衰老程序发挥作用的，它已成为一个重要指标来增加作物遗传改良的潜力。Huang[12]等认为植物叶片在衰老过程中，内源激素含量可能最先发生变化，由此导致叶绿体和蛋白质降解，光合速率下降。在20世纪30年代末就有科学家发现细胞分裂素延缓叶片衰老的效应，其主要通过转录因子调控途径、信号转导途径和代谢途径等提高细胞抗氧化酶的活性、减少膜脂类的过氧化作用、促进活性氧的清除、增加光合作用、降低对乙烯和脱落酸的敏感性延缓植物叶片的衰老[13，14]。王哲[15]用PSAG12-ipt融合基因转化烟草，全株青叶片数明显增多，植株下部叶片衰老得到明显延缓。李秋庆[16]用PSAG12-IPT基因转化辣椒，实验结果表明阳性植物出现叶片衰老延缓及植株生命周期延长等现象，花的衰老也有所延缓。
2.2 提高作物产量
细胞分裂素对植物的生理功能和作用是多方面的，具有诱导营养物质向其含量高的部位运输的能力，是提高灌浆效率的重要调控因子。在生产实践中，施用外源细胞分裂素可有效增加籽粒的重量，提高座果率以及增大果实等[17]。ipt基因在水稻醇溶蛋白种子特异性表达启动子驱动下的表达使得烟草种子的iPA含量提高了4.73 倍，种子的重量增加了12.8%[18]。毛自朝等[19]将果实专一性启动子2A12驱动ipt基因在番茄中的表达，发现果实中的细胞分裂素增高，番茄的坐果率、产量以及果实中的干物质和粗蛋白均有不同程度的提高，且果实采摘后贮藏保鲜时间延长了1-2周。很多科学工作者已把这项技术应用于转化水果、农作物、花卉和蔬菜等研究之中，这为提高农作物、果蔬的产量与品质提供了新的途径。
2.3 诱导单性结实
外源细胞分裂素能够促进黄瓜、西瓜、梨和苹果的未授粉果实的发育，从而产生无籽果实。在番茄中利用果实特异性启动子大量表达ipt基因能得到稳定的单性结实株系[20]，这为细胞分裂素调控植物的单性结实提供了直接证据。毛自朝等[19]将果实专一性启动子2A12驱动ipt基因在番茄中的表达，也得到了无籽番茄。黄瓜ipt基因CsIPT2在授粉后的黄瓜果实发育中表达量上调，且在黄瓜天然单性结实前期和人工诱导的单性结实后期表达量均有增加，推测其在黄瓜单性结实果实发育中发挥着重要作用[21]。
2.4 参与抗逆反应
编码异戊烯基转移酶基因在作物中表达，诱导植物体内产生活体酶和逆境胁迫蛋白等生理变化，促进光合作用，产生次生代谢物质，使细胞对环境胁迫因子、机械损伤或昆虫咬伤等作出响应。
2.4.1 抗旱
在干旱条件下，细胞分裂素可诱导过氧化氢体生成过氧化氢酶，叶绿素含量增加，促进了光呼吸作用，提高了植物的抗旱能力，同时抑制了脱落酸的作用，延缓了叶片的衰老。张雷等[22]研究转ipt基因四季海棠中发现，阳性植株细胞分裂素浓度增加，植株变矮，节间变短，叶片面积、气孔密度和直径均有不同程度的减小，主根发达且长度增加，在渗透胁迫条件下，植株体内脯氨酸含量和SOD活性较野生植株都明显增加，抗旱能力增强。玉山江·麦麦提[23]研究也表明，在干旱胁迫条件下ipt转基因水稻的细胞分裂素和叶绿素含量显著升高、叶面温度稍低、叶片衰老延缓、抗旱性增加、作物产量增加。
2.4.2 抗病虫害
细胞分裂素在调控植物的超越补偿反应调控系统中起着重要作用，遭受昆虫取食的叶片，细胞分裂素含量增加，有效地促进气孔开放，降低气孔的扩散阻力而提高光合作用，促进伤口愈合；同时导致植株体内的次生代谢过程发生了变化，产生抗虫效应的毒害或趋避作用的化合物，从而产生抗虫效应。李海林等[24]研究表明转CaMV35S-ipt基因的甘蓝型油菜自交品种S65表现高抗蚜虫，T1-3较野生型对蚜虫的抑制率均为100%，而野生型植株表现高感蚜虫，极易受到蚜虫侵害。Smigocki等[25]将蛋白酶抑制剂II基因启动子-ipt融合基因转化烟草，发现转基因植株能明显抑制桃蚜的生长发育。这种方法与导入抗虫基因相比更接近于植物的天然防御能力，这将为植物基因工程技术研制抗虫新品种提供新的的基因和思路。
2.4.3 抗寒
外源ipt基因的表达，细胞分裂素含量增加，叶片叶绿素含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量以及根系活力均增加，POD、SOD活性降低速率减慢，有利于植物抵抗低温环境。张晓等[26]利用基因枪法将Leafy-ipt基因导入高羊茅草，转基因株系植株的抗寒性明显提高。王婷婷[27]研究表明转ipt基因的草地早熟禾耐冷性显著提高，随着气温的降低，细胞膜受损伤程度低，出现冻害表型的时间晚，持绿期较长，具有很好的应用前景。李书钦[28]将ipt-bar双元基因转入水稻，也得到了强抗冷性植株，且千粒重和有效穗均有所增加。
2.5 其他作用
ipt基因转化植物提高细胞分裂素的含量，除了具有延缓植物叶片衰老、诱导单性结实、提高农作物的产量与品质、参与抗逆反应外，还能提高转化率和诱导率[29]、产生雄性不育后代、增强作物耐涝的能力[30]，还能作为选择标记基因筛选转化子[31]。但过量表达ipt基因将导致花不同程度的败育和种子的萌发率降低[32]。
3 展望
分子生物学和基因工程技术的发展及应用大力推动了细胞分裂素和异戊烯基转移酶基因在植物基因工程的研究与应用，但解析植物中细胞分裂素的合成代谢与器官发生发育过程的关系还需进一步探讨，尤其是细胞分裂素表达量以及细胞分裂素与其他激素的相互作用对植物生理代谢的调控以及器官发生发育过程的作用关系还需进一步研究。我们期待今后利用特异启动子与异戊烯基转移酶基因融合培育出更多品质优良的作物新品种。
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