大便隐血检测试剂盒
贾丹妮++王琳
摘 要：为研究不同的标记pH值和载金垫干燥温度对大便隐血（FOB）检测试剂（胶体金法）灵敏度的影响，在人血红蛋白等电点略高处设置pH值7.5，8.0，8.5，9.0，9.5以及载金垫干燥温度37℃和45℃，进行临床试验和灵敏度测试以及稳定性实验。结果表明，所制备的大便隐血检测试剂（胶体金法）中，标记pH=8.0-9.0的试剂灵敏度明显高于9.0以上，载金垫37℃烘干的显色效果明显好于45℃烘干，其中，标记环境pH=8.5与载金垫干燥温度37℃的灵敏度最高，可以作为大便隐血检测试剂制备的最优工艺条件。
关键词：大便隐血；pH值；干燥温度；灵敏度
中图分类号：R446 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）13-0182-04
Effect of pH and Drying Temperature on the Sensitivity of Fecal Occult Blood Diagnostic Kit
Jia Danni， Wang Lin
（PEREFCT EASE BIOTECH （BEIJING） CO.，LTD， Benjing 101111）
Abstract：This experiment designed different markup pH of Hb monoclonal antibody and drying temperature of colloidal gold cushion， to study the influence of different acid and alkali environment and gold cushion drying temperature on the sensitivity of Fecal occult blood （FOB） detection kit （colloidal gold method）. Set five pH （7.5，8.0，8.5，9.0，9.5） and two gold cushion drying temperature （37℃ and 45℃）， clinical trials and sensitivity test and stability test were carried out， the results showed that the kit sensitivity of tag pH （8.0～9.0） was significantly higher than that of above 9.0， gold cushion drying effect on 37 ℃ is significantly better than that of 45℃， among them， the tag environment pH of 8.5 and gold cushion drying temperature of 37 ℃ has the highest sensitivity， which can be used as a preparation of the optimal process conditions of Fecal occult blood diagnostic kit.
Key words：fecal occult blood；pH value；drying temperature；sensitivity
临床数据表明，威胁人类生命的主要疾病中，大肠癌已位列前茅，其中欧美国家的大肠癌死亡率已上升到第二位[1]。大肠癌早期并无症状，一旦有症状，多数患者已达中晚期，有研究表明，大肠癌患者的早期生存率（5年）可达92%，是进展期的11倍多，因此，大肠癌的早期筛查具有非常重要的意义[2]。有研究表明，大肠癌及癌前病变的粪便隐血阳性检出率比其他肠道疾病高，但肉眼观察不到，因此，大便隐血是大肠癌早期的一个重要指标[3]。目前，以大便隐血为指标，较为确切有效的筛查大肠癌的方法较多，其中胶体金免疫层析检测法的特异性和敏感性较传统的化学方法均有提高，且敏感性高于化学法40%[4-5]。胶体金免疫层析检测法用于定性检测人粪便样品中的血红蛋白（Hb），与化学方法-联苯胺法、邻甲苯胺法相比，其抗干扰性强，不易受铁剂、过氧化酶、维生素C等物质的影响，假阳性率低[6-7]；比匹拉米洞法更具灵敏度[8]。
大便隐血检测试剂（胶体金法）的检测效果易受制备过程中溶液酸碱度和干燥温度的影響，本实验以单克隆抗体标记过程中胶体金溶液pH值以及载金垫干燥过程中温度对大便隐血成品试剂灵敏度的影响展开讨论，以优化制备工艺。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器设备
1.1.1 主要原材料
Hb单克隆抗体（包被），Boson Biotech.，Co.Ltd。
Hb单克隆抗体（标记），Boson Biotech.，Co.Ltd。
硝酸纤维素膜（NC膜），上海杰一生物生物技术有限公司。
1.1.2 实验设备
电磁加热搅拌器，C-MAG-MS4，广州仪科实验室技术有限公司。
台式离心机，H1650-W，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
37℃恒温培养箱，DHP-9032B，上海米青科实业有限公司。
1.2 大便隐血检测试剂（胶体金法）的制备工艺
胶体金制备→单克隆抗体包被、标记→金标结合垫的制备→半成品、成品组装→结果检测。
操作要点：
胶体金制备：选择柠檬酸三钠还原法，用C-MAG-MS4型电磁加热搅拌器制备胶体金溶液[9]。
单克隆抗体包被：在NC膜上质控线处包被羊抗鼠IgG，在检测线处包被Hb单克隆抗体，过夜干燥。
单克隆抗体标记：调节胶体金溶液pH值，将纯化后的Hb抗体以最佳标记量与胶体金溶液结合，并加入BSA封闭，使其终浓度为1%。14000r/min高速冷冻离心30min，弃去上清，留沉淀，并复溶至原体积的1/10。
金标结合垫的制备：在复溶后的复合物中依次加入山羊血清、胶体金工作液和吐温20，使其占混合液比例分别为43.5%、43.5%和4.3%，混合液均匀铺于玻璃纤维素膜上，使其浸透后置于干燥箱烘干。
1.3 胶体金溶液pH值和载金垫干燥温度的设定
一般认为，单克隆抗体标记的最适pH应在蛋白质等电点（pI）略偏碱的条件下，蛋白质和胶体金才能牢固地结合，而选择最适pH值时，pH远大于pI的胶体金颗粒也不会聚沉，外观上与略偏减条件下颜色差别不大[10]。人血红蛋白等电点为7.23，本实验在大于其等电点处，设计五个不同pH值。标记Hb单克隆抗体前，预先加入不同量的0.2M K2CO3调节胶体金溶液pH值分别为7.5，8.0、8.5、9.0、9.5。以烘干方式干燥载金垫的温度一般不超过50℃，因此，按照工艺条件标记抗体，铺制载金垫后分为两批，设置两个温度，一个接近人体温（37℃），另一个设为45℃，烘箱干燥1h。
1.4 成品试纸条组装
将干燥后的载金垫与样品垫、吸水滤纸一起粘贴于带有NC膜并包被了Hb单克隆抗体的PVC底板上，彼此之间留有1～2mm的重叠；切条宽度为4mm，组装于扣板内。如图1所示。
2 结果与分析
2.1 临床样本检测
有研究表明，便隐血实验的阳性结果与大肠癌发生部位无关[11]，故收集临床已确诊且有完整资料的大肠癌患者的大便样本130份（其中包括直肠癌和结肠癌样本各65份）；收集正常人的大便样本42份。即阳性样本130份，阴性样本42份。用五个pH及两个烘干温度条件下制备的大便隐血检测试剂分别检测上述临床样本，10min内判读结果，并与万华普曼生物工程有限公司试剂的检测效果对比，结果如表1、表2、表3。
由表1、2结果可知，上述pH=7.5，烘干温度37℃和45℃条件下制备的试剂分别出现了2例和1例假阳性，其他四种条件下制备的试剂对正常人的大便样本全部判断正确，无假阳性出现；对临床阳性样本的检测准确率均在90%以上，其中以pH=8.5，烘干温度37℃检测准确率最高（99.23%）；对阳性样本的检测准确率，除pH=9.5分别与pH=8.0-9.0的有差异（p<0.05），其他两两之间均无显著差异（p>0.05），表明pH=9.5条件下制备试剂的检测准确率较低。进而与已上市的万华普曼生物工程有限公司试剂检测结果对比，结果见表3，表明在PH=8.0-9.0制备的试剂已接近其效果，可以作为诊断大便隐血的依据。
2.2 灵敏度检测
用1.3中不同标记pH值以及载金垫烘干温度下制备的大便隐血（FOB）检测试剂（胶体金法），检测不同浓度的FOB标准品，10min内判读，检测结果如表4。
由表4可见，本研究制备的大便隐血（FOB）检测试剂，标记pH=8.0-9.0的试剂灵敏度明显高于9.0以上，37℃烘干的显色效果明显好于45℃烘干；pH=7.5制备的试剂刚好能达到200ng/ml（国家限定标准），但2.1中其检测准确率较低；pH=9.0，37℃烘干制备的最低检测限可达150ng/ml；pH=9.5制备的未能达到200ng/ml（国家限定标准）；pH=8.0制备的最低检测限为120ng/ml；pH=8.5，37℃烘干制备的最低检测限可达110ng/ml，已经低于国家限定标准200ng/ml，灵敏度较高，适合检测微量大便隐血。
2.3 37℃加速稳定性研究
对制备试剂的稳定性进行考察，于37℃恒温培养箱加速培养，分别在5天，10天，15天，20天，25天取出测试，结果标记pH=8.0，8.5，9.0制备的试剂在25天时仍与初始检测样品检测结果的符合率为100%，稳定性较好；标记pH=7.5和9.5的试剂在分别在15天和10天时，灵敏度和清晰程度已达不到初始效果。
3 讨论
上述实验结果表明，本研究制备的大便隐血检测试剂（胶体金法）检测准确率已接近市售试剂。
灵敏度检测结果显示，标记pH=9.0以上制备的试剂，阳性结果的质控线和检测线清晰程度均较弱；pH=8.0和pH=8.5制备的试剂，在标准品浓度≧150ng/ml时，均显示强阳性，120ng/ml時才显示弱阳；pH=7.5制备的试剂，灵敏度刚好达到200ng/ml，且检测准确率较低，可能其酸碱度，还未达到最适，性能不太稳定；而载金垫烘干温度为37℃，pH=8.5的最低检测限可达110ng/ml。
同一浓度下，检测线的清晰程度不同，pH=9.0以下的明显比pH=9.0以上的清晰，可能是因为胶体金溶液pH值过高，远大于人血红蛋白的等电点（7.23），此时蛋白整体带负电荷，而胶体金颗粒也带负电荷，二者互相排斥，而且蛋白此时比较亲水，吸附金颗粒所需的疏水作用和静电作用都减弱，特异性反应也减弱；而pH=8.0和pH=8.5的胶体金溶液环境略高于蛋白等电点，蛋白中部分氨基酸带负电，被金颗粒排斥，而某些等电点较高的氨基酸仍带正电，能较好的吸附到金颗粒表面，这样氨基酸序列可以得到充分延展，此分段氨基酸序列的表征有利于特异性结合位点的暴露[12]。此时蛋白比较疏水，疏水作用力使蛋白与金颗粒更加牢固的结合。
灵敏度检测结果显示，同一pH下，37℃灵敏度高于45℃，可能是因为37℃更适合蛋白吸附作用的环境，胶体金有吸附酶的特性，并能保持其特性[13]。有研究表明，温度对蛋白质的吸附影响较大，载金垫干燥温度高于37℃时可能吸附量可能已经达到饱和，45℃时抗体蛋白可能已经部分变质，与胶体金结合能力减弱[14]。
4 结语
综合分析与讨论的结果，标记抗体时pH=8.0和pH=8.5的胶体金溶液制备的大便隐血（FOB）检测试剂（胶体金法）灵敏度均较高，可达120ng/ml，其中pH=8.5，载金垫烘干温度37℃的灵敏度最高，最低检测限可达110ng/ml，表明适当的标记pH值和金垫烘干温度可以共同影响大便隐血检测试剂的灵敏度。检测时选择pH=8.5，载金垫烘干温度37℃的条件，有利于大便中极微量隐血的检测，适于大肠癌以及癌前病变筛查时现场大批量使用，特别是基层医疗机构和医疗资源缺乏的亚太地区，为有肠胃道疾病潜在风险的患者提供及早就医的诊断依据[15]。
参考文献
[1]Ahmedin J， Rebecca S， Elizabeth W， et al. Cancer statistics， 2008[J]. CA：a cancer journal for clincians， 2008， 58（2）：71-96.
[2]Koshiji M， Yonekuar Y， Saito T， et al. Microsatellite analysis of fecal DNA for colorectal cancer detection[J].Surg Oncol， 2002，80（01）：30-40.
[3]黄珏，田相龙，宋冬霞.大便隐血与大肠疾病关系的研究[J].中国当代医药，2014，21（35）：163-165.
[4]Wong C K，Fedorak R N，Prosser C I，et al. The sensitivity and specificity of guaiac immunochemical fecal occult blood tests for the detection of advanced colonic adenomas and cancer[J]. Int J Colorectal Dis，2012，27（12）：1657-1664.
[5]嚴俊，徐东杰，李其龙.胶体金法和免疫比浊法大便隐血检测在人群结直肠癌筛查中的应用[J].中国肿瘤，2014，23（02）：92-96.
[6]杨学祥，张新德，张世杰，赵劲松.三种方法检测大便隐血的分析比较[J].实用医技杂志，2007，14（05）：579-580.
[7]张惠娟.对胶体金试纸法测定便隐血试验的评价与比较[J].现代中西医结合杂志，2007，16（23）：3376-3376.
[8]黎海东，谢文锐.两种大便隐血常规测定方法的比较探讨[J].吉林医学，2014，35（18）：3993-3994.
[9]付云洁，刘志国，武玉香.胶体金免疫层析法快速检测食品中金霉素残留[J].食品科学，2010，31（02）：191-194.
[10]杨小姣.胶体金免疫层析快速检测氯霉素技术研究[D].西北农林科技大学，2007.
[11]邹海蛟，林雪迟，苏丽君，周江，李子博，吴璇.大便隐血与大肠癌的关系浅析[J].内蒙古中医药，2010，29（24）：5-5.
[12]罗丽，张绍武，陈伟，潘泉.基于分段氨基酸组成成分的蛋白质相互作用预测[J].生物物理学报，2009，25（04）：282-286.
[13]蒋辉.两种便隐血检测方法比较[J].检验医学与临床，2011，8（21）：2589-2590，2592.
[14]唐振兴，石陆娥，钱俊青.壳聚糖凝胶吸附蛋白质机理研究[J].精细化工，2004，21（11）：833-836.
[15]Sung J J， Lau J Y， Young G P， et al. Asia Pacific consensus recommendations for colorectal cancer screening[J].Gut，2008，57（08）：1166-1176.
